Teknik Pengecatan Atau Pewarnaan Basil

1) Teknik Pengecatan Bakteri Secara Sederhana

Sel–sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus pandang  (transparan) jika diamati dengan mikroskop cahaya biasa sehingga sukar dilihat alasannya sitoplasma selnya memiliki indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antar sel dan latar belakangnya sanggup dipertajam dengan mewarnai sel–sel tersebut dengan zat- zat warna. 

Pewarna yang paling umum digunakan ialah “pewarna sederhana“, disebut demikian alasannya hanya digunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan basil gampang bereaksi dengan pewarna- pewarna sederhana alasannya sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif ). 

Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya basil dengan bermacam–macam tipe morfologi ( kokus, basilus, vibrio, spirilum, dan sebagainya) dari materi – materi lainya yang ada pada olesan yang diwarnai. Selain itu sanggup pula diamati struktur-struktur tertentu menyerupai endospora. Berbeda dengan spesimen hidup, sel–sel yang diwarnai terfiksasi pada beling obyek sehingga sanggup disimpan sebagai dokumentasi untuk jangka waktu lama.  

Berikut akan disampaikan mekanisme pewarnaan/pengecetan basil secara sederhana 

a. Bahan yang dibutuhkan : 

• Olesan – olesan mikroorganisme  
• Laruran zat warna metilen blue
• Larutan zat warna karbol fuksin 
• Bak warna 
• Air suling dalam botol pijit/ botol cuci 
• Kertas serap 
• Mikroskop, minyak celup, kertas lensa 

b) Prosedur/Cara melakukan: 

1. Gunakan olesan basil yang telah difiksasi, dengan memakai 2 olesan  untuk masing – masing mikroorganisme. Olesan pertama akan diwarnai dengan metelin blue dan yang kedua akan diwarnai dengan karbol fuksin 
2. Dengan berpedoman gambar berikut, lakukan pewarnaan sederhana sebagai berikut :  - 

• Letakkan beling – beling obyek berisi olesan yang akan diwarnai di atas kolam pewarna dan genangi olesan tersebut dengan zat warna yang dimaksud. Bila digunakan metilen blue biarkan olesan terwarnai selama 1-2 menit, jika digunakan karbol fuksin biarkan olesan terwarnai selama 15- 30 detik.
• Peganglah beling obyek dengan pinset atau penjepit lain dan miringkan. Bilaslah zat warna tersebut dengan air hingga warna  yang terkandung dalam air yang mengalir dari beling obyek tersebut hanya tinggal sedikit sekali.
• Seraplah air yang tersisa pada permukaan spesimen dengan kertas serap. 

2) Pengamatan

Amatilah masing- masing preparat di bawah mikroskop dengan obyektif celup minyak tanpa beling tutup (mulailah dengan obyektif berkekuatan terendah dan berangsur–angsur diganti dengan yang berkekuatan tinggi). Pada setiap olesan amati morfologi spesimen anda (bentuk, susunan, macam- macam stadium, struktur khusus menyerupai endospora). Gambarkanlah bagan pengamatan anda pada tiap–tiap olesan dengan skala dan warna yang sesuai, Cantumkan  pula nama masing–masing mikroorganisme. Tanyakan kepada guru apabila ada yang belum jelas. Hasil pengamatan buatlah kesimpulan dan presentasikan di depan kelas. 

Secara umum proses pewarnaan basil bisa dilakukan sebagai berikut  

• Bakteri haruslah diambil dari suatu biakan yang masih muda, kira- kira umur 24 jam, merupakan usia yang baik untuk mengatakan bentuk morfologinya. Jika ingin melihat basil yang sudahmembentuk spora, maka perlulah diambil  basil yang sudah lebih tua, yaitu dari suatu biakan yang berumur 2 hingga 3 kali 24 jam. 
• Bakteri diratakan di atas beling obyek/glass obyek  yang bersih, seluas kira-kira 1 cm2 . Hindarilah pengambilan basil yang terlalu banyak. Jika tidak diratakan tipis-tipis, maka basil akan bertumpuk sehingga investigasi bentuknya satu persatu tidak akan jelas. 
• Jika sudah kering, sediaan perlu dilewatkan pada nyala api perlahan -lahan supaya basil menempel pada beling obyek, sehingga tidak akan terhapus apabila sediaan dicuci. Jaga jangan hingga bidang yang mengandung basil terkena nyala api. 
• Zat warna diteteskan pada bidang yang mengandung bakteri. Juga mungkin seluruh beling obyek tersebut direndam miring dalam zat warna, hal ini bergantung pada sifat khusus pewarnaan, dan kadang- kadang juga bergantung kepada banyak sedikitnya beling obyek (preparat ) yang harus  dibuat. Zat warna diberi waktu beberapa usang supaya diserap oleh basil yang sudah kering, tergantung dari sifat khas zat warna yang digunakan . 
• Sediaan dicuci dengan alkohol atau asam encer, untuk menghilangkan zat warna yang berlebihan. Alkohol yang digunakan untuk mencuci sanggup berupa alkohol 15%  hingga 95%, kadang juga diharapkan alkohol 100%. Cara mencucinya ialah dengan mencelupkan sediaan ke dalam alkohol atau ke dalam asam encer dengan tanpa dikocek. Ada pula zat warna yang dicuci dengan air murni ataupun air kran. 
• Tunggu sediaan hingga kering kemudian diperiksa dengan mikroskop, jika perlu dengan memakai minyak cedar (minyak imersi atau minyak celup). Jika dikehendaki , sediaan sanggup ditutup dengan beling epilog sebelum ditempatkan di atas piringan mikroskop. Sediaan yang diinginkan untuk disimpan usang perlu perlakuan sebagai berikut: Permukaan yang mengandung basil ditetesi balsem kanada kemudian ditutup dengan beling epilog yang bersih. Sebelum kering, sediaan dihentikan diletakkan miring. Sesudah balsem kanada kering, gres sediaan sanggup dimasukkan ke kotak penyimpan sediaan, dalam posisi miring. Selanjutnya preparat disimpan dalam daerah gelap dan sejuk, biar supaya zat warna tidak lekas luntur dan pudar. Lebih terang terlihat  pada gambar berikut: 

3) Pewarnaan Gram

Prosedur pewarnaan sederhana yang anda lakukan menyerupai pada klarifikasi sebelumnya, memungkinkan untuk melihat basil dengan jelas, tetapi tidak sanggup membedakan jenis- jenis basil yang berbeda dengan morfologi yang sama. Pada tahun 1884, spesialis bakteriologi Denmark secara kebetulan menemukan mekanisme pewarnaan Gram. Pewarnaan ini mungkin merupakan salah satu mekanisme yang amat penting dan paling banyak digunakan dalam pembagian terstruktur mengenai bakteri. Melalui  metode ini , basil sanggup dipisahkan secara umum menjadi dua kelompok besar yaitu: 

• Organisme yang sanggup menahan kompleks pewarna  primer ungu kristal iodium hingga pada final mekanisme (sel –sel tampak biru gelap atau ungu), disebut Gram positif 
• Organisme yang kehilangan kompleks warna ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol namun kemudian diwarnai oleh pewarna tandingan safranin (sel- sel tampak merah muda ) disebut Gram negatif.  

Karena kemampuanya untuk membedakan satu kelompok basil tertentu dari kelompok lainya, pewarnaan Gram disebut juga pewarnaan diferensial. Sekalipun mekanisme yang sempurna dari pewarnaan Gram masih belum terang , diketahui bahwa komposisi dinding sel basil Gram-positif berbeda dari basil Gram-negatif dan ini diduga berperan dalam terjadinya reaksi Gram yang berbeda–beda . Boleh jadi dinding sel yang lebih tebal pada basil Gram positif menyusut oleh perlakuan alkohol alasannya terjadinya dehidrasi, mengakibatkan pori- pori dinding sel menutup sehingga mencegah larutnya kompleks ungu kristal iodium pada langkah pemucatan. Pada pihak lain, sel–sel Gram negatif memiliki kandungan lipid yang lebih tinggi pada dinding selnya dan lipid pada umumnya larut dalam alkohol dan aseton. Larutnya lipid oleh pemucatan yang digunakan dalam pewarnaan Gram diduga memperbesar pori- pori dinding sel dan inilah yang mengakibatkan proses pemucatan pada sel- sel Gram negatif berlangsung lebih cepat. Terdapat perbedaan yang faktual dalam laju pemucatan antara sel-sel Gram positif dan Gram negatif. Terlepas dari sempurna atau tidaknya dugaan tersebut, yang terang dinding sel itulah yang merupakan penghalang terhadap pemucatan pada sel – sel Gram positif. Pendapat ini di dukung oleh kenyataan bahwa berubahnya atau dibuangnya dinding  sel basil Gram positif mengakibatkan organisme tersebut berkembang menjadi Gram negatif. 

Perbedan reaksi Gram bukanlah suatu fenomena yang mutlak dan kaku, melainkan merupakan perbedaan laju lepasnya  kompleks ungu kristal –iodium dari sel pada langkah pemucatan. Organisme Gram positif sekalipun sanggup mengatakan reaksi Gram negatif jika mengalami pemucatan yang berlebihan.  Faktor- faktor yang sanggup menjadikan keragaman dalam reaksi Gram ialah : 

• Pelaksanaan fiksasi panas terhadap olesan 
• Kerapatan sel pada olesan 
• Konsentrasi dan umur reagen-reagen yang digunakan untuk pewarnaan Gram 
• Sifat konsentrasi dan jumlah pemucat yang dipakai 
• Sejarah biakan 

Olesan basil yang dipanaskan secara berlebihan akan mengakibatkan pecahnya dinding sel. Dalam keadaan demikian maka sel–sel Gram positif akan melepaskan warna primer dan mendapatkan warna tandingan. Hal ini mendukung teori bahwa reaksi Gram tergantung pada struktur dinding sel.  Olesan yang baik hendaknya jangan terlalu tebal atau terlalu tipis. Pada pewarnaan Gram, olesan yang terlampau tebal tidak akan memucat secepat menyerupai olesan dengan kerapatan yang normal. 

Sebagai pemucat, etanol 95 % bekerja paling lambat, sedangkan aseton paling cepat sehingga pemucat yang paling banyak digunakan ialah adonan etanol 95% dan aseton  dengan perbandingan (1: 1), Namun untuk siswa yang masih mencar ilmu melaksanakan pewarnaan Gram  sebaiknya memakai pemucat yang bekerja lambat yaitu dengan etanol 95 % untuk memperkecil kemungkinan terjadinya pemucatan yang berlebihan. 

Sejarah biakan yang dimaksud tersebut ialah mencakup umur biakan serta keasaman atau alkalinitas (pH) medium daerah basil yang bersangkutan ditumbuhkan.  Biakan organisme Gram positif yang lebih renta (terutama apabila mengatakan autolisis) dan yang ditumbuhkan dalam medium asam seringkali tampak gram negatif atau gram variabel (artinya biakan yang sama menampakkan sel-sel baik Gram positif maupun Gram negatif. Hal ini berkaitan dengan permebilitas dinding sel pada biakan renta yang mengakibatkan hilangnya sifat Gram positif. Tetapi organisme Gram negatif tidak menjadi Gram positif terlepas dari umur atau medium yang dipergunakan. Secara singkatnya, reaksi Gram hanya sanggup diandalkan bagi biakan berumur 24 jam atau kurang, dan janganlah terlampau mempersoalkan teramatinya beberapa sel Gram negatif di dalam suatu preparat yang sebagian besar menampakkan sel- sel Gram positif. 

Sumber http://gudangbukusekolah.blogspot.com

Share this post

Berlangganan update artikel terbaru via email: