Mengenal (Pcr) Polymerase Chain Reaction Dan Tahapan Dalam Amplifikasi Dna
PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada kawasan spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang dipakai sebagai pembatas kawasan yang diperbanyak yaitu DNA untai tunggal yang urutannya embel-embel dengan DNA templatnya. Proses tersebut seolah-olah dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif.
PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in vivo). Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan (templat) yang mengandung DNA-target (yang akan di amplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan tamat fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3’. Setelah kedua primer melekat pada DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang embel-embel dengan urutan nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3’ dengan gugus 5’ fosfat dNTP yang ditambahkan. Sehingga proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah 5’→3’ dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang embel-embel dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA templat.
PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA sasaran dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis oleh DNA polimerase.
PCR merupakan suatu teknik perbanyakan molekul DNA dengan ukuran tertentu secara enzimatik melalui prosedur perubahan suhu. Secara ringkas, prinsip PCR sanggup dijelaskan sebagai berikut. Pada suhu 94-95oC, DNA mengalami denaturasi (pembelahan untai ganda menjadi untai tunggal). Waktu yang diharapkan untuk proses ini sekitar 30 detik pada suhu 95oC atau 15 detik pada suhu 97oC. Apabila DNA sasaran mengandung banyak nukleotida G/C, suhu denaturasi sanggup ditingkatkan. Denaturasi yang tidak lengkap akan menjadikan renaturasi secara cepat, sedangkan waktu denaturasi yang terlalu usang sanggup menghipnotis enzim taq polymerase. Hal ini sangat besar lengan berkuasa terhadap keberhasilan proses PCR. Umumnya sebelum proses siklus PCR dimulai sering kali dilakukan pre denaturasi selama 3-5 menit, untuk menyakinkan bahwa molekul DNA sasaran yang ingin dilipatgandakan jumlahnya benar-benar terdenaturasi.
Tahapan PCR
Denaturasi
Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan lantaran suhu denaturasi yang tinggi menjadikan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, contohnya reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90 oC – 95 oC.
Penempelan primer
Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju kawasan yang spesifik yang embel-embel dengan urutan primer. Pada proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan embel-embel pada templat. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50oC – 60oC. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya, contohnya pada 72 oC.
Reaksi polimerisasi (extension)
Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi pada suhu 72oC. Primer yang telah melekat tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3’nya dengan penambahan dNTP yang embel-embel dengan templat oleh DNA polimerase.
Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka kawasan yang dibatasi oleh dua primer akan di amplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang berupa untai ganda), sehingga mencapai jumlah copy yang sanggup dirumuskan dengan (2n)x. Dimana n yaitu jumlah siklus dan x yaitu jumlah awal molekul DNA. Jadi, seandainya ada 1 copy DNA sebelum siklus berlangsung, setelah satu siklus, akan menjadi 2 copy, setelah 2 siklus akan menjadi 4, setelah 3 siklus akan menjadi 8 kopi dan seterusnya. Sehingga perubahan ini akan berlangsung secara eksponensial. PCR dengan memakai enzim Taq DNA polimerase pada tamat dari setiap siklus akan menjadikan penambahan satu nukleotida A pada ujung 3’ dari potongan DNA yang dihasilkan. Sehingga nantinya produk PCR ini sanggup di kloning dengan memakai vektor yang ditambahkan nukleotida T pada ujung-ujung 5’-nya. Proses PCR dilakukan memakai suatu alat yang disebut thermocycler.
0 Response to "Mengenal (Pcr) Polymerase Chain Reaction Dan Tahapan Dalam Amplifikasi Dna"
Posting Komentar