Prosedur Uji Salmonella
Untuk melaksanakan deteksi cemaran Salmonella pada produk makanan, ada beberapa metoda yang direkomendasikan untuk dipakai oleh industri maupun laboratorium analisa lainnya. Salah satunya ialah metoda yang diterbitkan oleh Badan Standarisasi Internasional, yaitu Standar ISO 6579 : 2002 Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the detection of Salmonella spp.
Dalam metoda ISO 6579 : 2002 ini terdiri dalam tiga tahapan, tahap pertama ialah pre-enrichment, tahap kedua ialah selective enrichment, dan tahap ketiga ialah isolasi pada media biar selektif. Tahap preenrichment memakai media kultur cair yaitu Buffered Peptone Water (BPW). Pre-enrichment pada media kultur cair berfungsi untuk memperbaiki kondisi basil yang injured.Tahapan kedua ialah melaksanakan selective enrichment pada 2 jenis media kultur cair, yaitu Rappaport Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth (RVS) dan Muller Kaufman Tetrathionate Novobiocin Broth. Pada tahapan selective enrichment ini terjadi optimalisasi pertumbuhan Salmonella dan dihambatnya pertumbuhan bakteri-bakteri penyerta lainnya yang sanggup menggangu pertumbuhan Salmonella, sehingga sanggup semakin meminimalkan hasil false negatif. Tahap ini memakai 2 jenis media selektif yang bertujuan untuk memaksimalkan pertumbuhan dari banyak sekali spesies Salmonella yang mungkin terdapat pada sampel. Sebab, terkadang beberapa jenis spesies Salmonella sanggup tumbuh baik pada media kultur RVS namun tidak sanggup tumbuh pada MKTTn, maupun sebaliknya.
Tahapan ketiga ialah melaksanakan isolasi atau plating pada media biar selektif yaitu XLD agardan Rambach Agardengan metoda streak/gores memakai jarumose. Pada media XLD agar, Salmonella akan memakai kandungan xylose, laktosa, dan sukrosa menjadi zat asam yang mengakibatkan phenol red bermetamorfosis kekuningan atau oranye. Salmonella juga akan menghasilkan hydrogen sulfit sebagai hasil dari pemanfaatan thiosulfate dan garam besi (III) yang mengakibatkan koloni Salmonella berwarna hitam.
Pada media Rambach Agar, Salmonella akan tumbuh dan tampak sebagai koloni berwarna merah. Hal ini disebabkan oleh pemanfaatan propylene glycol dan reaksinya dengan pH indikator yang menghasilkan warna merah. Media Rambach Agar mengandung substrat chromogenic untuk mendeteksi aktifitas pemecahan β-galactosidase oleh Coliform, sehingga sanggup dibedakan antara Salmonella dengan basil Coliform lainnya.
Pertumbuhan c0l1form pada media Rambach Agar akan tampak sebagai koloni yang berwarna kehijauan atau biru-violet. Sedangkan basil dari kelompok Gram-negatif lainnya akan tampak sebagai koloni yang tak berwarna, contohnya Proteus dan Shigella.
Contoh lain dalam pengujian Salmonella ialah identifikasi Salmonella pada sampel mayonnaise pada (SNI 01-4473-1998) dengan syarat negative kalau jumlah koloni 25 gr.
Prosedur pengujian deteksi Salmonellasesuai dengan SN-01-2332.2-2006 perihal Tahap-Tahap Uji Salmonella. Tahap uji ini terbagi menjadi beberapa tahap, yaitu
1) Pra-Pengkayaan
Metode ini diawali dengan pengambilan sampel seberat 25 gr atau 225 ml dengan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan media pengkayaan (lactose broth). Selanjutnya teladan yang akan diuji dimasukkan ke dalam wadah plastik yang telah disterilkan dan ditambahkan 225 ml larutan Lactose Broth (LB). Selanjutkan homogenkan sampel selama 2 menit untuk dianalisa. Secara aseptis, pindahkan larutan teladan dalam wadah steril yang sesuai. Inkubasi 24 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C. Lanjutkan pengujian sesuai dengan prosedur.
Silahkan anda amati gambar proses sebelum dan sehabis proses pengkayaan. Diskusikanlah dengan teman kelompok anda, apa yang mengakibatkan perubahan warna. Reaksi apa yang terjadi pada proses tersebut.
2) Tahap Pengkayaan
Tahap pengkayaan diawali dengan mengencangkan tutup wadah dan mengkocok perlahan teladan yang diinkubasi. Untuk produk perikanan dengan tingkat kontaminasi tinggi, Selanjutnya pindahkan 0,1 ml larutan teladan ke dalam 10 ml Rappaport-Vassiliadis (RV) medium dan 1 ml larutan teladan ke dalam 10 ml Tetrathionate Broth (TTB); Untuk jenis produk perikanan lain, pindahkan 1 ml larutan teladan ke dalam masing-masing 10 ml SCB dan 10 ml TTB
Inkubasi media pengkayaan selektif sebagai berikut:
inkubasi pada RV medium selama 24 jam± 2 jam pada suhu 42°C ± 0,2°C (Water bath);
Inkubasi pada TTB selama 24 jam ± 2 jampada suhu 43°C ± 0,2°C (Water bath);
inkubasi pada TTB dan SCB selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C (Inkubator).
3) Tahap Inkubasi
Tahap ini diawali dengan mengocok tabung (dengan vortex) dan dengan mengggunakan jarum ose (3mm) gores TTB yang diinkubasi ke dalam media HE, XLD dan BSA. Siapkan BSA sehari sebelum dipakai dan simpan di tempat gelap pada suhu ruang. Gores ke dalam media yang sama dari RV Broth atau SCB. Inkubasi cawan BSA, HE dan XLD selama 24 jam pada suhu 35°C ± 1°C. Amati kemungkinan adanya koloni Salmonella.
4) Pengamatan Morfologi Salmonella
Pengamatan morfologi Salmonella dilakukan dengan mengambil 2 atau lebih koloni Salmonella dari masing-masing media Agar selektif setelah 24 jam± 2 jam inkubasi. Koloni-koloni Salmonella yang khas (typical) ialah sebagai berikut:
- Pada Hectoen Enteri (HE) Agar. Koloni hijau kebiruan hingga biru dengan atau tanpa inti hitam. Umumnya kultur Salmonellamembentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau hampir seluruh koloni terlihat berwarna hitam.
- Pada XLD Agar. Koloni merah jambu (pink) dengan atau tanpa inti hitam. Umumnya kultur Salmonellamembentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau hampir seluruh koloni terlihat berwarna hitam.
- Pada Bismuth Sulphite Agar (BSA). Koloni coklat, abu-abu atau hitam; adakala metalik. Biasanya media di sekitar koloni pada awalnya berwarna coklat, lalu bermetamorfosis hitam (haloeffect) dengan makin lamanya waktu inkubasi.
Metode lain dalam pengujian ialah dengan uji biokimiadan uji serologi. Dalam pengujian ini dibentuk kontrol positif yaitu sampel yang telah diberi biakan kultur Salmonella sebagai pembanding. Dari pengkayaan selektif, biakan dari MKTTn dan RVS diinokulasikan pada media BGA dan XLD untuk tahap inokulasi dan identifikasi. Pada tahap ini hanya biakan dari BGA yang berasal dari MKTTn yang memperlihatkan pertumbuhan koloni. Sedangkan pada media XLD tidak ada pertumbuhan koloni. Selanjutnya koloni dari biakan BGA dilakukan uji identifikasi yaitu uji biokimia dan uji serologi. Uji biokimia yang dilakukan antar lain sebagai berikut :
a. Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
Uji Triple Sugar Iron biar (TSIA) merupakan metode yang dipakai untuk melihat kemampuan mikroorganisme dalam memfermentasikan gula. Media yang diguanakan dalam uji TSIA ini ialah TSIA biar yang mengandung 3 macam gula, yaitu glukosa 0,1%, laktosa 0,1%, dan sukrosa 0,1%. Selain itu, juga terdapat indicator fenol merah yang mengakibatkan perubahan warna dari merah orange menjadi kuning dalam suasana asam. TSIA juga mengandung natrium trisulfat, yaitu suatu substrat untuk penghasil H2S, ferro sulfat menghasilkan FeS (precipitat), bewarna hitam untuk membedakan basil H2S dengan bakteribakteri lainnya.Konsentrasi glukosa ialah 1/10 dari konsentrasi laktosa atau sukrosa agar fermentasi glukosa saja yang terlihat.
Pada uji TSIA warna media bermetamorfosis merah lantaran basil bersifat basa Perubahan warna media ini menerangkan bahwa basil ini tidak memfermentasi laktosa dan sukrosa. Pada media kawasan butt media berubah berwarna kuning ini menerangkan basil memfermentasi glukosa. Pembentukan gas positif ini hasil dari fermentasi H2 dan CO2 sanggup dilihat dari pecahnya dan terangkatnya agar. Pembentukan H2S positif ditandai dengan adanya endapan berwarna hitam.
b. Uji urease
Uji urease dipakai untuk mengetahui kemampuan mikroba menghidrolisis urea menjadi amonia. Uji ini memakai urease broth sebagai media diferensial yang sanggup membedakan basil penghasil eksoenzim yaitu enzim yang berfungsi untuk menghidrolisa urea menjadi ammonia. Kandungan urease broth antara lain larutan buffer, urea, nutrient, serta indicator phenol red.
Uji urease memperlihatkan hasil positif kalau terjadi perubahan warna media dari kuning menjadi merah keunguan lantaran amoniak yang dihasilkan mengakibatkan lingkungan menjadi basa. Hasil uji urease negatif kalau tidak terjadi perubahan warna dari kuning menjadi merah keunguan.
c. Uji Dekarboksilasi Lysin
Uji Dekarboksilasi Lysin memakai media Xylose-Lysine- Desoxycholate. Agar medium dipakai untuk isolasi Salmonelladanmemilah organisme lain dengan cara memfermentasi xylose, dekarboksilasi lysine dan produksi H2S. Fermentasi xylose sangat lazim bagi kebanyakan organisme enterik kecuali, Shigella, Providencia,Edwardsiella. Pada media ini, Salmonellaakan membentuk koloni merah dengan inti hitam, sedang Pseudomonas sanggup tumbuh dengan warna merah dan Eschericia berwarna kuning. Mikroba lain yang sanggup tumbuh pada media ini antara lain Arizona, Proteus, Aerobacter, Klebsiella,Citrobacter. Begitu banyak mikroba yang sanggup tumbuh, sehingga media ini kurang sanggup memilah Salmonellapada tahap awal. Sehingga lebih baik dipakai untuk tahap konfirmasi kontaminan Salmonella.
d. Uji β-galaktosidase
Uji β-galaktosidase dipakai utuk identifikasi beberapa jenis basil menyerupai Salmonella. Enzim β-galaktosidase merupakan enzim yang sanggup mengubah laktosa menjadi glukosa dan galaktosa. Beberapa mikroorganisme menyerupai E. c0l1, sanggup memakai laktosa sebagai sumber karbon. Selain laktosa, substrat alamiah dari enzim, ialah materi yang sangat penting, ONPG (o-nitro-phenyl-β-D-galactopyranoside), sanggup dipakai pula. Β-galaktosidase sanggup mengkatalisis ONPG menjadi galaktosa dan o-nitrofenol. ONPG tidak berwarna tetapi setelah hidrolisis menjadi o-nitrofenol, akan timbul warna kuning pada larutan yang alkali. beberapa jenis basil yang bisa melaksanakan fermentasi terhadap karbohidrat Streptococcus, Lactobacillus, Zygomonas, Saccharomycetes, Escherichia, Enterobacter, Salmonella.
e. Uji Indol
Uji Indol bertujuan untuk memilih kemampuan basil dalam memecah asam amino triptofan. Media ini biasanya dipakai dalam indentifikasi yang cepat. Hasil uji indol yang diperoleh negatif lantaran tidak terbentuk lapisan (cincin) berwarna merah muda pada permukaan biakan, artinya basil ini tidak membentuk indol dari tryptopan sebagai sumber karbon, yang sanggup diketahui dengan menambahkan larutan kovacs. Asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan gampang sanggup dipakai oleh mikroorganisme akhir penguraian protein.
f. Uji Voges Proskauer
Uji Voges Proskauer bertujuan untuk mengidentifikasi jenis basil Untuk membedakan basil Escherichia c0l1 dengan Enterobacteraerogenes. Hasilnya uji ini negatif, lantaran tidak terbentuk warna merah pada medium setelah ditambahkan anapthol dan KOH, artinya hasil tamat fermentasi basil ini bukan asetil metil karbinol (asetolin).
Selain uji biokimia, juga terdapat uji serologi untuk mengidentifikasi adanya Salmonella dalam banhan pangan. Dalam uji serologi tidak terjadi aglutinasi pada penambahan antisera polivalen O, H, dan Vi . Jika hasil dari uji biokimia dan uji serologi teladan atau sampel berbeda dengan hasil kontrol positif, maka koloni yang tumbuh dari biakan BGA pada teladan bukanlah Salmonella, sehingga hasil dari pengujian ini sanggup dinyatakan sebagai negatif koloni/25 gr. Hasil ini telah memenuhi syarat menyerupai pada SNI 01-4473-1998 yang mensyaratkan cemaran Salmonellapada mayonnaise ialah negatif koloni/25 gr.
Salmonellapositif kalau pada uji biokimia yang dilakukan alhasil sebagai berikut:
- TSIA : butt (+), slant (-), gas positif atau negatif dan H2S positif atau negatif.
- Hidrolisis urea : negatif
- Dekarbosilasi lysine : positif
- Reaksi voges proskauer : negatif
- Produksi indol : negatif
- Uji serologi: terjadi aglutinasi pada penambahan antisera polivalen O, H, dan Vi.
g. Uji Biokimia Tambahan
Uji biokimia perhiasan sanggup dilakukan kalau pada biakan masih diragukan adanya Salmonella atau tidak. Tahapan uji biokimia perhiasan ialah sebagai berikut:
a) Purple Lactose Broth
Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring yang telah diinkubasi selama 24 jam – 48 jam kedalam phenol red lactose atau purple Lactose Broth. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C, tetapi amati setelah 24 jam.
Hasil dinyatakan positif kalau terjadi pembentukan asam (media berubah kuning) dan ditemukan gas pada tabung durham. Selain itu kalau hanya terjadi pembentukan asam saja, sudah sanggup dinyatakan positif. Umumnya Salmonellamemberikan hasil negatif ditunjukkan dengan tidak terbentuknya gas pada tabung durham dan warna merah (phenol red sebagai indikator) atau ungu (bromcresol purple sebagai indikator) pada seluruh media.
b) Purple Sucrose Broth
Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring yang telah diinkubasi selama 24 jam – 48 jam kedalam Phenol red sucrose atau purple sucrose Broth. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C, tetapi amati setelah 24 jam.
Positif, apabila terjadi pembentukan asam (kuning) dan gas pada tabung durham. Apabila hanya terjadi pembentukan asam, maka sanggup dinyatakan positif. Umumnya Salmonellamemberikan hasil negatif, ditunjukkan dengan tidak terbentuknya gas pada tabung durham dan warna merah (phenol red sebagai indikator) atau ungu (bromcresol purple sebagai indikator) pada seluruh media.
c) Medium MR-VP
Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring ke dalam media MR-VP Broth dan inkubasikan selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C.
d) Uji VP
Pindahkan 1 ml MR-VP Broth yang telah diinkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C ke dalam tabung reaksi steril dan inkubasikan kembali MR-VP Broth selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C untuk pengujian Methyl Red. Tambahkan 0,6 ml Alpha Alphanaphtol dan kocok. Tambahkan 0,2 ml larutan 40% KOH dan kocok kembali. Untuk mempercepat reaksi tambahkan sedikit Kristal kreatin, dan amati alhasil setelah 4 jam. Perubahan warna menjadi merah muda eosin hingga merah mirah delima (ruby) pada media memperlihatkan reaksi positif.Umumnya Salmonella memperlihatkan reaksi VP negatif.
e) Uji MR
Tambahkan 5 tetes - 6 tetes indikator Methyl Red kedalam media MR - VP yang telah diinkubasi selama 96 jam. Amati alhasil dengan segera. Umumnya Salmonellamemberikan reaksi positif, ditandai dengan terjadinya difusi warna merah pada media. Terjadinya warna kuning memperlihatkan reaksi negatif.
f) Simmon Citrat Agar
Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring kedalam media Simmon Citrate Agar miring dengan cara menggores biar miring dan menusuk biar tegak. Inkubasikan selama 96 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C.
Hasil dinyatakan positif apabila terjadi pertumbuhan yang biasanya diikuti dengan perubahan warnadari hijau menjadi biru. Umumnya Salmonella memperlihatkan hasil citrate positif. Namun kalau tidak ada atau sedikit sekali pertumbuhan dan tidak terjadi perubahan warna, maka hasil dinyatakan negatif.
0 Response to "Prosedur Uji Salmonella"
Posting Komentar